Amadoriasi I termostabilizzata da Aspergillus Fumigatus

Data di pubblicazione

29-09-2017

Codice

DEIB.17.020.A

Stato

Disponibile

Data di priorità

23-06-2017

Fase

Domanda di brevetto internazionale (PCT)

Titolare

Politecnico di Milano, IIT

Dipartimento

DIPARTIMENTO DI ELETTRONICA, INFORMAZIONE E BIOINGEGNERIA

Autori

Alfonso Gautieri, Emilio Parisini, Federica Rigoldi, Stefano Donini, Alberto Redaelli

Descrizione

La misura dell’emoglobina glicata (HbA1c) nel sangue è un metodo molto efficace per monitorare l’insorgenza e lo sviluppo del diabete. È possibile rilevare HbA1c sfruttando le proprietà deglicanti dell’enzima Amadoriasi, che può essere incluso in un sistema di monitoraggio di HbA1c rapido, facile ed economico, recentemente commercializzato. Una delle problematiche di questa soluzione, però, è rappresentata dalla non soddisfacente assoluta stabilità degli enzimi; questa influenza sia la conservazione sia la stabilità rispetto ai cambiamenti di temperatura, limitando quindi l’applicabilità dei sistemi “a enzima”. Inoltre, la glicazione delle proteine del cibo è un effetto collaterale di molti trattamenti termici (ad esempio la pastorizzazione del latte), che risulta in un’alterazione del gusto e del profilo nutrizionale del prodotto. L’enzima Amadoriasi avrebbe, quindi, un potenziale uso nel mercato alimentare nel controllo e nella prevenzione della glicazione delle proteine nel cibo, ma gli enzimi dovrebbero essere in grado di sopportare le alte temperature utilizzate nei trattamenti termici senza che ne venga influenzata l’attività. Oggetto di questa invenzione è un enzima Amadoriasi ingegnerizzato, ottenuto tramite un approccio combinato sperimentale e computazionale, che presenta un’aumentata stabilità rispetto all’enzima naturale. L’approccio computazione è stato usato per identificare le coppie di aminoacidi che potessero essere mutati in cisteine al fine di introdurre uno o più ponti disolfuro (cioè un legame covalente cisteina-cisteina) nella struttura della Amadoriasi I. Sperimentalmente, invece, sono state esaminate diverse mutazioni e sono state identificate quelle in cui l’introduzione del legame disolfuro (o dei legami disolfuro) fosse veramente efficace per aumentare la stabilità termica dell’enzima senza influenzarne l’attività. - ENGLISH - The measurement of glycated haemoglobin (HbA1c ) in the blood is a very powerful method for monitoring the insurgence and development of diabetes. A method for HbA1c detection exploits the deglycating properties of Amadoriases enzyme, which can be included in a fast, easy and cost-effective HbA1c monitoring system. Such enzyme-based system has been recently proposed and commercialized. However, one of the issues of these enzyme sensors is their unsatisfactory absolute activity and stability. This issue affects storage, stability against temperature changes, which in turn limits the applicability of enzymatic HbA1c monitoring systems based on enzymes. Moreover, glycation of food proteins is a drawback effect of several thermal treatment (e.g., milk UHT treatment), which results in alteration of the sensory and nutritional profile of the products. Amadoriase enzymes have a potential use in food industry in controlling and preventing protein glycation in food products, but the enzymes should be able to sustain the thermal treatments without losing activity. Combined computational and experimental approach was used to obtain an engineered Amadoriase enzyme with increased stability with respect to the wild-type one. Using a computational approach, pairs of amino acids that can be mutated to cysteines were identified in order to introduce one or two disulphide bonds (i.e., cysteine-cysteine covalent bond) in the structure of Amadoriase I. Experimentally, several mutants were tested and those where the introduction of the disulfide bond(s) has proved effective in increasing the thermal stability of the enzyme without affecting the activity were identified.

Campo di applicazione

Questo enzima ingegnerizzato può essere usato, per esempio, per la misura dell’emoglobina glicata per la rilevazione e il monitoraggio del diabete e per la riduzione dell’indesiderata reazione di Maillard nel processing del cibo (per esempio durante i processi di pastorizzazione o sterilizzazione degli alimenti). - ENGLISH - This engineered enzyme can be used for measurement of glycated hemoglobin for diabetes detection/monitoring and to reduce undesired Maillard Reaction in food processing (for example during pasteurization or sterilization).

Vantaggi

L’enzima ingegnerizzato ha un’elevata stabilità termica; infatti, l’attività di quest’ultimo nei confronti del suo substrato naturale (fruttosil lisina) rimane circa la stessa fino a temperature di circa 80°C, mentre l’enzima naturale è attivo solo a T < 50°C. Inoltre, si ritiene che un’aumentata stabilità alle alte temperature implichi anche maggiore stabilità in condizioni più blande (es. benefici su conservazione e data di scadenza). Il considerevole aumento della stabilità termica dell’enzima ingegnerizzato permette, quindi, di ipotizzarne l’uso per prevenire la glicazione proteica in applicazioni dove è importante la stabilità a lungo termine e la stabilità contro le variazioni di temperatura e/o l’uso ad alte temperature. - ENGLISH - The engineered enzyme has a high thermal stability; the activity of this enzyme towards its natural substrate (fructosyl lysine) is retained up to a temperature of 80°C, whereas the wild-type enzyme is active only at T < 50°C. Importantly, increased thermal stability likely involves longer stability at milder conditions (i.e. longer storage and expiry date). The remarkable increase of thermal stability of the engineered enzymes allows envisioning the use of our engineered form of the enzyme to prevent aminoacid glycation in application where it is important the long-term stability, stability against temperature variations and/or the use of high temperature.

Stadio di sviluppo

Campioni di enzima ingegnerizzato sono stati ottenuti e sperimentalmente testati presso i nostri laboratori. - ENGLISH - samples of the engineered enzyme were obtained and experimentally tested.

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